Dibandingkan
kromatografi gas (GC), HPLC mempunyai beberapa keunggulan, diantaranya dapat
digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile), isolasi zat secara termal tidak stabil, pemisahan
senyawa anorganik, dan dapat dioperasikan pada suhu kamar.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan
tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes
melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan
400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel
yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana
akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan
molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih
baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan
yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian
yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.
HPLC
|
GC
|
|
Fasa diam
|
Fisa diam berupa adsorben yang tidak boleh larut dalam
fasa gerak.
Ukuran yang lebih kecil (5 s/d 10 mm) dan tekanan sampai 6000 psi. Ukuran yang kecil dari
fasa diam menyebakan fasa diam mempunyai luas permukaan yang besar, keseimbangan
antar fasa menjadi lebih baik dan efisien pemisahan dipertinggi.
|
Fasa diam berupa suatu cairan bertitik didih tinggi dan
proses serapannya lebih banyak berupa partisi yang berupa padatan dan adsopsi
memainkan peranan utama.
|
Fasa gerak
|
Fasa gerak merupakan suatu cairan.
|
fase gerak
adalah gas seperti helium, hidrogen,
atau nitrogen.
|
Kolom
|
Ada 2 tipe:
- Kolom analitik
dengan performance tinggi, diameter dalam 1-6 mm
- Kolom preparative,
diameter lebih besar
Tabung kolom dibuat dari kaca dan baja tahan karat.
Panjang kolom 0,3-6 meter atau lebih, rata-rata 0,9 m. Kolom yang lebih
panjang akan menghasilkan resolusi bertambah baik, tetapi perlu tekanan
tinggi. Tabung kolom dapat dikelilingi selubung air (water jacket) untuk pengaturan suhu. Jenis isi kolom (kemasan
kolom) tergantung cara kromatografi yang dipakai (adsorpsi, partisi, atau
penukaran ion).
|
Ada dua tipe utama kolom
dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube panjang dan tipis berisi
material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase diam yang
berikatan dengan pada bagian terdalam permukaannya.
Kolom biasanya
dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai 4 meter, dengan
diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat disesuakan
dengan oven yang terkontrol secara termostatis.
Kolom
dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori.
Tanah ini dilapisis dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer
lilin.
|
Detektor
|
Ada beberapa cara untuk
mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah
dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.
 Detektor yang
paling banyak digunakan adalah detektor fotometer sinar tampak atau sinar
ultraviolet, dan detektor indeks bias.
Fungsi
detektor untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan, dan mengukur banyaknya
komponen. Syarat-syarat yang baik detektor adalah mempunyai kepekaan tinggi,
gangguan noise sedikit, daerah respon linear cukup luas, memberikan respon
terhadap semua tipe senyawa, dan tidak peka terhadap perubahan kecepatan
aliran dan perubahan suhu.
|
Ada beberapa tipe
detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala merupakan detektor
yang umum dan lebih mudah untuk dijelaskan daripada detektor alternatif
lainnya.
Dalam mekanisme reaksi detektor ionisasi nyala, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion dan elektron dapat dideteksi. Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.  |
Jumlah sample
|
Sampel
cuplikan harus dimasukkan ke dalam kolom sebagai lapisan setipis mungkin.
Ukuran sampel sekitar 1-20 mL. Dua cara untuk melakukan injeksi: cara injeksi dan
katup pemasukan cuplikan mikro (micro-sampling
valve)
 |
Sample harus
mudah menguap dan memiliki kstabilan termal pada suhu pengoperasian. Sampel
dimasukkan ke dalam aliran gas melalui lubang injeksi yang terletak pada
bagian atas kolom. Suatu aliran gas yang sinambung mengelusi
komponen-komponen dari kolom dan kemudian mencapai detektor yang dihububngkan
dengan suatu sistem pencatat. Berikut diagramnya
 |
Prinsip pemisahan /
Prinsip kerja
|
Mula-mula
solven diambil melalui pompa Solven ini kemudian masuk ke dalam katup injeksi
berputar, yang dipasang tepat pada sample loop. Dengan pertolongan
mikrosiring, sample dimasukkan ke dalam sample loop yang kemudian
bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi
oleh detektor yang ditampilkan oleh perekam/recorder. Tekanan solven diatur
dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa memasok solven pada tekanan
konstan hingga tekanan ± 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa
milliliter per menit.
Output akan
direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili
satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi
untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau
orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa
pada kondisi yang sama.
Jika anda
menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah
diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu
retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah
dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.
Area yang
berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area
ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung
sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya, 
Ini berarti
dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu
berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.  |
Ada tiga hal yang dapat
berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran yang diinjeksikan pada
kolom:
-
Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.
-
Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase
diam
-
Molekul dapat tetap pada fase gas
Dari ketiga
kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.
Hasil akan
direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa
dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara
hati-hati kondisi dalam kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang tampak-tentu saja anda atau seseorang
lain telah menganalisa senyawa murni dari berbagai senyawa pada kondisi yang
sama.
Area dibawah
puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati detektor,
dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan
dengan monitor. Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna
hijau dalam gambar yang disederhanakan.
Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi dan memiliki area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya.
Mungkin saja
sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari kolom
dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area selain
tinggi puncak dapat dipergunakan dalam hal ini.
|
jazakullah atas artikelnya.. ;)